Περιφερική Διαβητική Νευροπάθεια και Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα

Ναταλία Δημητρακοπούλου, Ιωάννα Ελευθεριάδου, Νικολίστα Καφάση, Αναστάσιος Τεντολούρης, Αγλαΐα Δημητρακοπούλου, Ι. Αναστασίου, Ι. Μουρούζης, E. Jude, Νικόλαος Τεντολούρης

Περίληψη

Η περιφερική νευροπάθεια χαρακτηρίζεται από δομικές και λειτουργικές διαταραχές της μικροκυκλοφορίας και τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPCs, endothelial progenitor cells) μπορεί να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση των μικρών αγγείων των νεύρων (vasa nervosum). Η συσχέτιση των EPC με τις μικροαγγειοπαθητικές επιπλοκές του διαβήτη είναι διφορούμενη, ενώ τα δεδομένα σχετικά με τη συσχέτισή τους με την περιφερική νευροπάθεια αυτή καθαυτή είναι σπάνια. Στόχος της μελέτης μας ήταν να αξιολογήσουμε τις διαφορές στα κυκλοφορούντα προγονικά κύτταρα (CPCs, circulating progenitor cells) και σε 6 διαφορετικούς φαινοτύπους EPCs στο περιφερικό αίμα σε ασθενείς με και χωρίς περιφερική νευροπάθεια, καθώς και να ερευνήσουμε τη συσχέτιση της περιφερικής νευροπάθειας με τα επίπεδα των αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF, vascular endothelial growth factor),  στρωματικού παράγοντα-1 των κυττάρων (SDF-1, stromal cell-derived factor 1), μορίου προσκόλλησης των αγγειακών κυττάρων-1 (VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1), διακυτταρικού μορίου προσκόλλησης-1 (ICAM-1, intracellular adhesion molecule-1) και παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNFa, tumor necrosis factor a).

Στην μελέτη συμμετείχαν συνολικά 105 άτομα χωρίς κλινική μακροαγγειοπαθητική νόσο και σοβαρές συννοσηρότητες: 50 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και περιφερική νευροπάθεια, 30 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 χωρίς περιφερική νευροπάθεια και 25 υγιείς εθελοντές. Τα CPC και 6 διαφορετικοί φαινότυποι EPC αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα επίπεδα πλάσματος VEGF, SDF-1, VCAM-1, ICAM-1 και TNFa μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα κιτ ELISA.

Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στον αριθμό των CPC μεταξύ των 3 ομάδων των συμμετεχόντων, ενώ όλα οι φαινότυποι των EPCs που μελετήθηκαν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των 3 ομάδων. Οι ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια είχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό και των 6 EPCs φαινοτύπων σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς περιφερική νευροπάθεια και σημαντικά υψηλότερο αριθμό 5 EPCs φαινοτύπων σε σύγκριση με τους υγιείς εθελοντές. Τα επίπεδα των VEFG, VCAM-1, ICAM-1 και TNFa δεν διέφεραν μεταξύ των 3 ομάδων των συμμετεχόντων, αλλά οι ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα SDF-1 σε σύγκριση με τους υγιείς εθελοντές.

Αρκετοί φαινότυποι των EPCs αυξάνονται σε ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια με καλό γλυκαιμικό έλεγχο και χωρίς κλινική μικροαγγειοπαθητική νόσο ή άλλες σοβαρές συννοσηρότητες σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς περιφερική νευροπάθεια και με υγιή άτομα, ενώ τα επίπεδα SDF-1 μειώνονται παρουσία περιφερικής νευροπάθειας. Τα συμπεράσματά μας υποδεικνύουν ότι η περιφερική νευροπάθεια θα μπορούσε να συσχετιστεί με διαταραχή της κυκλοφορίας των EPCs και διαταραχή της εγκατάστασής τους στο τραυματισμένο ενδοθήλιο.

Diabetic Peripheral Neuropathy and Endothelial Progenitor Cells

Dimitrakopoulou N, Eleftheriadou I, Kafasi N, Tentolouris A, Dimitrakopoulou A, Anastasiou IA, Mourouzis I, Jude E, Tentolouris N

Abstract

DPN is characterized by structural and functional alterations of the microvasculature and endothelial progenitor cells (EPCs) may play an important role in the homeostasis of vasa nervosum. The association of EPCs with diabetic microvascular disease is ambiguous, while data regarding its association with DPN per se are scarce. The aim of our study was to evaluate the differences that occur in circulating progenitor cells (CPCs) and 6 different EPCs phenotypes in peripheral blood in patients with and without DPN, as well as to investigate for alterations in plasma vascular endothelial growth factor (VEFG), stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and cytokines levels.

A total of 105 participants without clinical macrovascular disease and severe comorbidities were included in the study: 50 patients with type 2 diabetes (DM) and DPN, 30 patients with type 2 DM without DPN and 25 healthy individuals. CPCs and 6 different EPCs phenotypes were assessed with flow cytometry. Plasma levels of VEGF, SDF-1, vascular cell adhesion protein-1 (VCAM-1), intracellular adhesion molecule-1 (ICAM) and tumor necrosis factor a (TNFa) were measured using commercially available ELISA kits.

No difference was observed in the number of CPCs among the 3 groups of participants, while all studied EPCs phenotypes differed significantly among the 3 groups. Patients with DPN had significantly higher numbers of all 6 EPCs phenotypes when compared with patients without DPN and significantly higher number of 5 EPCs phenotypes when compared with healthy individuals. VEFG, VCAM-1, ICAM-1 and TNFa, levels did not differ among the 3 groups of participants, but patients with DPN had significantly lower SDF-1 levels when compared with healthy individuals.

Several EPCs phenotypes are increased in patients with DPN with good glycaemic control and without clinical macrovascular disease or other severe comorbidities when compared with patients without DPN and with healthy individuals, while SDF-1 levels are decreased in the presence of DPN. Our findings suggest that DPN could be associated with impaired trafficking of EPCs and impaired EPCs homing to the injured endothelium.

Εισαγωγή

Η διαβητική νευροπάθεια αποτελεί τη συχνότερη μικροαγγειοπαθητική επιπλοκή του σακχαρώδη διαβήτη και εμφανίζεται σε ποσοστό που κυμαίνεται μεταξύ 20-50% (1, 2). Η συνηθέστερη μορφή διαβητικής νευροπάθειας είναι η χρόνια περιφερική αισθητικοκινητική νευροπάθεια (3). Επί του παρόντος δεν υπάρχει αιτιολογική θεραπεία της διαβητικής νευροπάθειας που να παρεμβαίνει στους παθογενετικούς μηχανισμούς και να αλλάζει τη φυσική πορεία της νόσου. Η ανακάλυψη νέων αιτιολογικών θεραπευτικών προσεγγίσεων αποτελεί πρόκληση για την ιατρική κοινότητα, η οποία έχει στραφεί στην προσπάθεια κατανόησης των υποκείμενων παθογενετικών μηχανισμών της διαβητικής νευροπάθειας, που πιθανώς θα επέτρεπε την εύρεση στοχευμένων θεραπειών.

Οι δυσμενείς επιδράσεις του διαβήτη τόσο στη μικροκυκλοφορία όσο και στην μακροκυκλοφορία οφείλονται κυρίως στην επίδραση της υπεργλυκαιμίας στο αγγειακό σύστημα και συγκεκριμένα στα ενδοθηλιακά κύτταρα (4). Ένας τομέας με έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον είναι η μελέτη του ρόλου της δυσλειτουργίας των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (EPCs, endothelial progenitor cells) στο διαβήτη. Τα ΕΡC είναι ένας ετερογενής πληθυσμός κυττάρων σε διάφορες φάσεις ωρίμανσης που βρίσκονται στις λεγόμενες “θέσεις” (niches) βλαστικών κυττάρων (stem cells) στον μυελό των οστών και απελευθερώνονται στην κυκλοφορία ως απόκριση σε συμπαθητικά και αλγεινά (nociceptive) ερεθίσματα και ως απάντηση στα αυξημένα επίπεδα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF, vascular endothelial growth factor), του στρωματικού παράγοντα-1 των κυττάρων (SDF-1, stromal cell-derived factor 1) και των κυτταροκινών που συντίθενται από τους ισχαιμικούς ιστούς (5, 6).

Μέχρι πρόσφατα, η προσπάθεια για κατανόηση της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας περιοριζόταν στις δυσμενείς επιδράσεις της υπεργλυκαιμίας επί της μικροαγγειακής κυκλοφορίας. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει το ρόλο επιπλέον παραγόντων, όπως των EPCs, που αναγνωρίζονται για την ουσιαστική συμμετοχή τους στην επιδιόρθωση του διαταραγμένου ενδοθηλίου και στην νεοαγγειογένεση (7, 8). Σύμφωνα με τα νεότερα δεδομένα, τόσο οι μικροαγγειοπαθητικές όσο και οι μακροαγγειοπαθητικές επιπλοκές του σακχαρώδη διαβήτη δεν αποδίδονται μόνο στην καταστροφική επίδραση της υπεργλυκαιμίας στο αγγειακό ενδοθήλιο, αλλά και σε διαταραγμένους μηχανισμούς επιδιόρθωσης των ενδοθηλιακών βλαβών (7, 8).

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσουμε για πρώτη φορά τη συσχέτιση μεταξύ της περιφερικής νευροπάθειας και των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων (CPCs, circulating progenitor cells)/EPCs σε άτομα με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, καθώς και των επιπέδων των VEGF, SDF-1, μορίου προσκόλλησης των αγγειακών κυττάρων-1 (VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1), διακυτταρικού μορίου προσκόλλησης (ICAM-1, intercellular adhesion molecule) και του παράγοντα νέκρωσης των όγκων a (TNFa, tumor necrosis factor a).

Άτομα και Μέθοδος της Μελέτης

Άτομα της Μελέτης

Στη μελέτη έλαβαν μέρος 105 άτομα, 50 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και περιφερική νευροπάθεια (ομάδα 1), 30 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 χωρίς περιφερική νευροπάθεια (ομάδα 2), καθώς και 25 άτομα χωρίς σακχαρώδη διαβήτη, παρόμοιας ηλικίας. Οι συμμετέχοντες της μελέτης με σακχαρώδη διαβήτη τόσο με όσο και χωρίς περιφερική νευροπάθεια στρατολογήθηκαν από τα Εξωτερικά Τακτικά Διαβητολογικά Ιατρεία του Διαβητολογικού Κέντρου του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου ΓΝΑ “Λαϊκό”. Οι συμμετέχοντες που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου ήταν προσωπικό του Νοσοκομείου.

Στη μελέτη είχαν τη δυνατότητα να λάβουν μέρος γυναίκες και άνδρες ηλικίας 40-75 ετών, μη καπνιστές και με δείκτη μάζας σώματος (BMI, body mass index) < 40 kg/m². Οι συμμετέχοντες με σακχαρώδη διαβήτη έπρεπε να έχουν ικανοποιητικό γλυκαιμικό έλεγχο με τιμές HbA1c < 8,5%. Άτομα με κλινικά εμφανείς μακροαγγειοπαθητικές επιπλοκές (ιστορικό ή συμπτώματα στεφανιαίας νόσου, αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου ή τιμές κνημοβραχιόνιου δείκτη (ABI, ankle-brachial index) ≤0.90), με παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια, με έλκος κάτω άκρων, ή με οποιαδήποτε συνοδό κατάσταση που θα μπορούσε να συνοδεύεται με αύξηση της νεοαγγειογένεσης, αποκλείσθηκαν από τη μελέτη. Επιπλέον κριτήρια αποκλεισμού ήταν η παρουσία νεφρικής νόσου (εκτιμώμενος ρυθμός σπειραματικής διήθησης (eGFR, estimated glomerular filration rate) < 30 ml/min/1,73m² ή λόγος αλβουμίνης προς κρεατινίνη ούρων (ACR, albumin to creatinine ratio) > 300 mg/g), η παρουσία σοβαρής ηπατικής νόσου, άλλες αιτίας περιφερικής νευροπάθειας, παρουσία νευρο-οστεοαρθροπάθειας Charcot, πρόσφατο χειρουργείο ή τραυματισμός (τους τελευταίους 3 μήνες πριν τη συμμετοχή στη μελέτη), παρουσία αυτοάνοσων νοσημάτων ή κακοήθειας και εμπύρετο νόσημα τις προηγούμενες 48 ώρες πριν τη συμμετοχή στη μελέτη.

Όλοι οι εξεταζόμενοι υπέγραψαν έντυπο συγκατάθεσης πριν τη συμμετοχή τους. Το πρωτόκολλο και το έντυπο ενημέρωσης και συγκατάθεσης εγκρίθηκαν από το Επιστημονικό Συμβούλιο του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου ΓΝΑ “Λαϊκό”. 

Μέθοδος της Μελέτης

Η μελέτη ήταν συγχρονική και περιλάμβανε μια επίσκεψη του εξεταζόμενου για τη διενέργεια των μετρήσεων στο Ερευνητικό Εργαστήριο του Διαβητολογικού Κέντρου της Α΄ Προπαιδευτικής Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών στο ΓΝΑ “Λαϊκό”. Η επίσκεψη για τη διενέργεια των εξετάσεων είχε περίπου διάρκεια 2 ωρών και έγινε σε συνθήκες ηρεμίας και σταθερής θερμοκρασίας 22-24 ºC.

Ο κάθε εξεταζόμενος προσήλθε στο Ερευνητικό Εργαστήριο το πρωί, μετά από νηστεία 10 ωρών. Οι εξεταζόμενοι δεν είχαν καταναλώσει αλκοόλ και καφέ για το ίδιο χρονικό διάστημα. Η λήψη των αντιδιαβητικών δισκίων ή η χορήγηση ινσουλίνης έγινε μετά το πέρας της εξέτασης.

Αρχικά ελήφθησαν τα δημογραφικά στοιχεία των εξεταζόμενων και το πλήρες ατομικό ιστορικό για συνύπαρξη νόσων και λήψη φαρμάκων, καθώς και για τις συνήθειες και τον τρόπο ζωής. Στη συνέχεια, έγινε μέτρηση των σωματομετρικών παραμέτρων, ενώ η μέτρηση της αρτηριακής πίεσης έγινε σε καθιστή θέση, δύο φορές με μεσοδιάστημα ενός λεπτού μεταξύ τους και υπολογίσθηκε ο μέσος όρος. Αρτηριακή υπέρταση θεωρήθηκε η λήψη αντιϋπερτασικής αγωγής ή/και η μέτρηση τιμών συστολικής αρτηριακής πίεσης μεγαλύτερες από ή ίσες με 140 mmHg ή/και τιμών διαστολικής αρτηριακής πίεσης μεγαλύτερες από ή ίσες με 90 mmHg (9).

Ακολούθως έγινε ψηλάφηση των περιφερικών σφύξεων των δύο κάτω άκρων και υπολογίσθηκε ο ΑΒΙ. Τιμές ΑΒΙ ≤ 0,9 θεωρήθηκαν ενδεικτικές παρουσίας περιφερικής αρτηριοπάθειας, τιμές < 0,7 ενδεικτικές σοβαρής περιφερικής αρτηριοπάθειας, ενώ τιμές > 1,3 ενδεικτικές ύπαρξης σκλήρυνσης Μönckeberg (10). Οι ασθενείς με τιμές ΑΒΙ > 1,3 υπεβλήθησαν σε περαιτέρω έλεγχο με υπερηχογραφία duplex-triplex των κάτω άκρων για τον αποκλεισμό της περιφερικής αγγειοπάθειας. Οι ασθενείς με τιμές ABI ≤ 0,9 ή με διάγνωση περιφερικής αγγειοπάθειας από την υπερηχογραφία duplex-triplex των κάτω άκρων αποκλείσθηκαν από τη μελέτη.

Στη συνέχεια ελέγχθηκε η παρουσία διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας. Οι συμμετέχοντες έπρεπε να είχαν υποβληθεί σε άμεση βυθοσκόπηση του αμφιβληστροειδούς με μυδρίαση της κόρης του οφθαλμού από έμπειρο οφθαλμίατρο το τελευταίο τρίμηνο πριν την εισαγωγή στη μελέτη. Αναλόγως των ευρημάτων οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε 2 κατηγορίες, σε αυτούς με βυθό χωρίς αλλοιώσεις ενδεικτικές διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας και σε αυτούς με μη παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια (μικροανευρύσματα, στικτές αιμορραγίες, κομβολογιοειδής μορφή φλεβών, σκληρά και μαλακά εξιδρώματα, αρτηριοφλεβικές αναστομώσεις) (11). Η παρουσία παραγωγικής αμφιβληστροειδοπάθειας (νεοαγγείωση, ενδοϋαλοειδική αιμορραγία, ανάπτυξη ινώδους ιστού, αποκόλληση αμφιβληστροειδούς) αποτελούσε κριτήριο αποκλεισμού.

Σε πρωινό δείγμα ούρων μετρήθηκε ο ACR και εκτιμήθηκε η παρουσία μικροαλβουμινουρίας. Τιμές ACR < 30 mg/g θεωρήθηκαν φυσιολογικές, τιμές 30-300 mg/gr θεωρήθηκαν μικροαλβουμινουρία, ενώ άτομα με τιμές > 300 mg/g  αποκλείσθηκαν από τη μελέτη (12). Ο eGFR υπολογίσθηκε με την εξίσωση της μελέτης Modification of Diet in Renal Disease (MDRD) και βάσει αυτού έγινε η ταξινόμηση στα 5 στάδια της χρόνιας νεφρικής νόσου (12). Η παρουσία σταδίου 4 και 5 χρόνιας νεφρικής νόσου αποτελούσαν κριτήριο αποκλεισμού της μελέτης. Ως παρουσία νεφροπάθειας ορίσθηκαν τιμές eGFR < 60 ml/min/1,73m² ή/και τιμές ACR > 30 mg/g.

Εκτίμηση Περιφερικής Νευροπάθειας

Αρχικά έγινε έλεγχος για την παρουσία περιφερικής νευροπάθειας με τον προσδιορισμό του δείκτη συμπτωμάτων νευροπάθειας (NSS, neuropathy symptom score) και του δείκτη ευρημάτων νευροπάθειας (NDS, neuropathy disability score). ΝSS ≥ 5 και NDS ≥ 3 ή NDS ≥ 6 ανεξάρτητα από την τιμή του NSS θεωρήθηκαν ενδεικτικά της παρουσίας περιφερικής νευροπάθειας (13).

Εργαστηριακές Εξετάσεις

Σε όλους τους εξεταζόμενους έγινε αιμοληψία για τον προσδιορισμό των HbA1c, γλυκόζης, ουρίας, κρεατινίνης, λιπιδίων (ολικής χοληστερόλης, τριγλυκεριδίων, HDL-χοληστερόλη και LDL-χοληστερόλη), γενικής αίματος, CRP, VEGF, SDF-1, TNFa και των μορίων προσκόλλησης VCAM-1 και ICAM-1.

Η HbA1c μετρήθηκε με τον αναλυτή DCA (DCA 2000+, Bayer HealthCare LLC, Elkhart, IN 46514 USA). Η γλυκόζη πλάσματος, τα λιπίδια, εκτός της LDL-χοληστερόλης, η ουρία και η κρεατινίνη μετρήθηκαν με αυτόματο αναλυτή. Η LDL-χοληστερόλη υπολογίσθηκε με βάση τον τύπο του Friedewald. Τα επίπεδα ων VEGF και SDF1 μετρήθηκαν με μέθοδο ELISA (R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA), ενώ οι συγκεντρώσεις των TNFa, VCAM-1 και ICAM-1 με τη μέθοδο Luminex (MILLIPLEX MAP Kit Human Cardiovascular Disease Magnetic Bead Panel 2, Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

Απομόνωση και Μέτρηση EPCs

Για την απομόνωση των CPCs/EPCs ελήφθησαν 8 ml  αίματος και συλλέχθηκαν σε σωληνάρια που περιέχουν EDTA. Τα δείγματα αίματος αποθηκεύτηκαν απευθείας σε θερμοκρασία 4^oC και τα περιφερικά μονοπύρηνα του αίματος (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells) απομονώθηκαν μέσα σε 2 ώρες όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις (14).

Για την αναγνώριση των κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν άμεσα συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα ως δείκτες κυτταρικής επιφάνειας: CD45, CD34, CD309 ή VEGF-R2/KDR, CD133 και CD31, συνδυασμένα με αντίστοιχα αντισώματα επισημασμένα με φθορίζοντα υλικά: CD45-APC-H7 (5μl; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), CD34-FITC (10μl; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), CD309 ή VEGF-R2/ KDR-PE (20μl; BD Biosciences,San Jose, CA, USA), CD133-APC (10μl; Miltenyi Biotec) και CD31-PE-Cy7 (10μl; BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Για την κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε το μηχάνημα κυτταρομετρίας BD FACSCanto ΙΙ, BD Biosciences στο Τμήμα Ανοσολογίας – Ιστοσυμβατότητας του Νοσοκομείου ΓΝΑ “Λαϊκό”, το οποίο είναι ικανό για τη συλλογή δεδομένων μέχρι και 50.000 κύτταρα ανά δευτερόλεπτο. Δεδομένα από 1.000.000 κύτταρα με χαμηλή έκφραση CD45 (CD45^dim) συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για κάθε δείγμα αίματος. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα BD FACSDIVA software, BD Biosciences.

Το ποσοστό των θετικών κυττάρων αξιολογήθηκε μετά από διόρθωση για το ποσοστό που αντιδρά με ένα μάρτυρα ισοτύπου συζευγμένο με τα αντίστοιχα φθορίζοντα υλικά APC-H7, FITC, ΡΕ, APC και PR-Cy7. Τα κύτταρα που εξέφραζαν τον φαινότυπο CD45^dim/CD34⁺/CD133⁺ χαρακτηρίστηκαν CPCs. Διαφορετικοί υποπληθυσμοί των EPCs θεωρήθηκαν οι φαινότυποι CD45^dim/CD34⁺, CD45^dim/CD34⁺/CD309⁺, CD45^dim/CD34⁺/CD31⁺, CD45^dim/CD34⁺/CD309⁺/CD31⁺, CD45^dim/CD34⁺/CD309⁺/CD133⁺ and CD45^dim/CD34⁺/CD309⁺/CD133⁺/CD31⁺ (7, 14).

Στατιστική Επεξεργασία

Όλα τα δεδομένα καταχωρήθηκαν σε ηλεκτρονική βάση δεδομένων για τη στατιστική επεξεργασία. Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 24.0 (IBM SPSS software version 24.0, NY, USA).

Αρχικά έγινε έλεγχος της κανονικότητας των μεταβλητών με το τεστ Kolmogorov-Smirnov. Για τις μεταβλητές με κανονική κατανομή χρησιμοποιήθηκαν παραμετρικές δοκιμασίες, ενώ για τις μεταβλητές με μη κανονική κατανομή μη παραμετρικές δοκιμασίες. Περιγραφικά, οι ποσοτικές μεταβλητές με κανονική κατανομή παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± σταθερή απόκλιση, ενώ οι μεταβλητές χωρίς κανονική κατανομή ως διάμεσος τιμή με το ενδο-τεταρτημοριακό εύρος (25% – 75%). Οι ποιοτικές μεταβλητές παρουσιάζονται ως απόλυτοι αριθμοί και ως ποσοστά του αντίστοιχου πληθυσμού. 

Η σύγκριση των ποιοτικών μεταβλητών μεταξύ των διαφόρων ομάδων της μελέτης έγινε με τη δοκιμασία Χ². Για τη σύγκριση των ποσοτικών μεταβλητών με κανονική κατανομή μεταξύ των 3 ομάδων της μελέτης χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση μεταβλητότητας μιας κατεύθυνσης (one-way analysis of variance ANOVA). Δεδομένου ότι δημιουργήθηκαν 3 ομάδες υπό διερεύνηση, ήταν δυνατές 3 συγκρίσεις κατά ζεύγη που έγιναν με δοκιμασίες ανάλυσης post hoc. Λόγω των συγκρίσεων μεταξύ πολλαπλών ομάδων και προκειμένου να μειωθεί το σφάλμα τύπου 1 χρησιμοποιήθηκε η διόρθωση κατά Bonferroni. Για τη σύγκριση των ποσοτικών μεταβλητών με μη κανονική κατανομή μεταξύ των 3 ομάδων της μελέτης χρησιμοποιήθηκε το Kruskal-Wallis H test, ενώ για τη σύγκριση κατά ζεύγη το Mann-Whitney U 2-independent samples t-test.

Η αναζήτηση συσχετίσεων μεταξύ των εξεταζόμενων παραμέτρων και της περιφερικής νευροπάθειας πραγματοποιήθηκε με τους συντελεστές συσχέτισης Pearson’s or Spearman’s, ανάλογα με τις εκάστοτε ενδείξεις.

Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίσθηκαν οι τιμές p < 0,05.

Αποτελέσματα

Δημογραφικά, Κλινικά και Εργαστηριακά Χαρακτηριστικά

Τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ομάδων μελέτης παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Οι υγιείς εθελοντές είχαν χαμηλότερο ΒΜΙ, λιγότερο συχνά αρτηριακή υπέρταση, χρησιμοποιούσαν λιγότερο συχνά στατίνες και είχαν χαμηλότερο ACR σε σύγκριση με τους ασθενείς με διαβήτη με ή χωρίς περιφερική νευροπάθεια.

Μεταξύ των ατόμων με διαβήτη η μόνη διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες ήταν ο υψηλότερος ACR στους συμμετέχοντες με περιφερική νευροπάθεια, αν και ο αριθμός των ασθενών με μικρολευκωματινουρία δεν διέφερε μεταξύ αυτών με και χωρίς περιφερική νευροπάθεια. Η χρήση στατίνων, ACEi, ανταγωνιστών του υποδοχέα της αγγειοτενσίνης ΙΙ (ARBs, angiotensin II receptor antagonists), μετφορμίνης, αναστολέων της διπεπτιδυλ-πεπτιδάσης 4 (DPP4i, dipeptidyl peptidase-4 inhibitors) και ινσουλίνης, που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον αριθμό των EPC δεν διέφεραν μεταξύ των δύο ομάδων.

Πληθυσμοί Προγονικών Κυττάρων

Δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στον αριθμό των CPCs μεταξύ των 3 ομάδων των συμμετεχόντων, ενώ όλοι οι φαινότυποι των EPCs που μελετήθηκαν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των 3 ομάδων (Πίνακας 2). Η υπο-ανάλυση έδειξε ότι οι ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια είχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό και των 6 φαινοτύπων των EPCs σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς περιφερική νευροπάθεια. Σε σύγκριση με τα υγιή άτομα, οι ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια είχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό 5 EPCs φαινοτύπων και υπήρχε τάση για στατιστικά σημαντική διαφορά για τον φαινότυπο CD45dim/CD34+/CD309+/CD31+. Ο αριθμός των EPCs δεν διέφερε μεταξύ των ατόμων με διαβήτη χωρίς περιφερική νευροπάθεια και υγιών εθελοντών.

Επίπεδα VEFG, SDF-1 και Κυτταροκινών

Τα επίπεδα των VEFG, VCAM-1, ICAM-1, TNFa και CPR δεν διέφεραν μεταξύ των 3 ομάδων των συμμετεχόντων (Πίνακας 3). Υπήρξε μία τάση για στατιστική σημαντική διαφορά για τα επίπεδα των SDF-1 μεταξύ των 3 ομάδων και η υπο-ανάλυση έδειξε ότι οι ασθενείς με διαβήτη και περιφερική νευροπάθεια είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα SDF-1 σε σύγκριση με τα υγιή άτομα (Πίνακας 3).

Συζήτηση

Το κύριο εύρημα της παρούσας συγχρονικής μελέτης είναι ότι ο αριθμός των EPCs είναι αυξημένος σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και περιφερική νευροπάθεια χωρίς κλινική μακροαγγειοπαθητική νόσο σε σύγκριση με ασθενείς με διαβήτη χωρίς περιφερική νευροπάθεια και σε σχέση με υγιείς εθελοντές, ενώ ο αριθμός των CPCs δεν διαφέρει μεταξύ των 3 ομάδων. Τα επίπεδα των VEGF, VCAM-1, ICAM-1 και TNFa δεν διαφέρουν μεταξύ των 3 ομάδων των συμμετεχόντων, ενώ τα επίπεδα του SDF-1 είναι χαμηλότερα σε ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια σε σύγκριση με τα υγιή άτομα. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι περιφερική νευροπάθεια θα μπορούσε να σχετίζεται με διαταραχή της κυκλοφορίας των EPC και με διαταραχή της εγκατάστασή τους στο τραυματισμένο ενδοθήλιο.

Η υπεργλυκαιμία είναι ο κύριος παράγοντας που συμβάλλει στην εμφάνιση της διαβητικής περιφερικής νευροπάθειας διαταράσσοντας τα νευρικά κύτταρα και προκαλώντας μικροαγγειοπάθεια των μικρών αγγείων των νεύρων (vasa nervosum), όπως τα ενδoνευρικά, περινευρικά και επινευρικά αγγεία (endoneurial, perineural και epineural vessels) (15). Το οξειδωτικό στρες θεωρείται το κοινό υποκείμενο μονοπάτι που προκαλεί τη βλάβη των νεύρων και οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (reactive oxygen species) πιστεύεται ότι μειώνουν τη αγγειοδιαστολή των επινευρικών αγγείων, οδηγώντας σε αγγειοσυστολή και λειτουργική ισχαιμία του νευρικού ιστού. Από την άλλη, τα ενδονευρικά αγγεία φαίνεται να έχουν ποικίλη βατότητα. Διφορούμενα είναι και τα δεδομένα σχετικά με τον αριθμό των αιμοφόρων αγγείων και την πυκνότητα τους (vessel density) σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη. Στα πρώιμα στάδια της νόσου, η πυκνότητα των ενδονευρικών αγγείων φαίνεται να είναι υψηλότερη σε σύγκριση με τα υγιή άτομα, ενώ αυτό δεν συμβαίνει σε ασθενείς με εγκατεστημένη διαβητική περιφερική νευροπάθεια. Θα μπορούσε να υποτεθεί ότι ο αριθμός των νευρικών τριχοειδών αυξάνεται σαν απάντηση στην ισχαιμία των νευρικών ιστών στα πρώιμα στάδια του διαβήτη, ενώ μετά από μακροχρόνια υπεργλυκαιμία μειώνεται ο αριθμός και ιδιαίτερα η λειτουργική πυκνότητα των νευρικών αγγείων (15-17). Δομικές διαταραχές των vasa nervosum έχουν επίσης αναφερθεί στην περιφερική νευροπάθεια, όπως ο πολλαπλασιασμός και η πάχυνση της βασικής μεμβράνης των ενδονευρικών αγγείων. Παρόλο που τόσο οι λειτουργικές όσο και δομικές διαταραχές των vasa nervosum είναι δεδομένες στην περιφερική νευροπάθεια και η ανεπαρκής παροχή αίματος συμβάλλει καθοριστικά στην παθογένεσή της, δεν είναι σαφές εάν η βλάβη των νευρικών ινών είναι ως επί το πλείστον αποτέλεσμα των μικροαγγειακών διαταραχών (16, 17). Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι τόσο τα επινευρικά όσο και τα περινευρικά αγγεία νευρώνονται από  συμπαθητικές νευρικές απολήξεις και η διαταραχή του αυτονόμου νευρικού συστήματος συμβάλλει περαιτέρω στην εκδήλωση περιφερικής νευροπάθειας (16, 17).

Τα EPC διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στην ομοιοστασία των vasa nervosum, καθώς οι διαταραχές των μηχανισμών αποκατάστασης του ενδοθηλίου και της νεοαγγειογένεσης μπορούν να συμβάλλουν περαιτέρω στην ισχαιμία των νευρικών ιστών (5, 8, 18, 19). Υπό φυσιολογικές συνθήκες τα EPCs απελευθερώνονται από τον μυελό των οστών, μεταναστεύουν στην περιοχή του τραυματισμένου ενδοθηλίου όπου παράγουν αγγειογόνους και νευροτροφικούς παράγοντες ή διαφοροποιούνται σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα και ενορχηστρώνουν τις διαδικασίες επανεπιθηλιοποίησης και νεοαγγειογένεσης (6).

Τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τον αριθμό των EPCs σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη είναι αντιφατικά, αλλά η δυσλειτουργία των EPCs, δηλαδή ο μειωμένος πολλαπλασιασμός, η μειωμένη κινητοποίηση, μετανάστευση, προσκόλληση και εγκατάσταση (homing) στο τραυματισμένο ενδοθήλιο, είναι ένα σταθερό εύρημα (5, 6, 20). Η μειωμένη προσκόλληση στη βασική μεμβράνη και η διαταραχή της εγκατάστασης στην περιοχή της ενδοθηλιακής βλάβης έχει αποδοθεί στην πάχυνση της βασικής μεμβράνης από τα AGEs (21).

Η συσχέτιση μεταξύ του χαμηλού αριθμού των EPCs και των μακροαγγειοπαθητικών επιπλοκών του διαβήτη είναι καλά εδραιωμένη, αν και ο πιθανός υποκείμενος μηχανισμός παραμένει ασαφής (8, 22). Ο πληθυσμός της μελέτης επιλέχθηκε προσεκτικά και κανένας από τους συμμετέχοντες δεν είχε κλινική μακροαγγειοπαθητική νόσο που θα μπορούσε να μειώσει τον αριθμό των EPCs. Στη βιβλιογραφία, τα δεδομένα σχετικά με τη συσχέτιση των προγονικών κυττάρων με τις μικροαγγειοπαθητικές επιπλοκές του διαβήτη νόσο είναι διφορούμενα.

Έχει βρεθεί ότι ο μειωμένος αριθμός των κυττάρων CD34+, CD34+/CD133+ και CD34+/CD133+/KDR προβλέπει την ανάπτυξη ή την επιδείνωση της μικροαγγειοπάθειας σε μια ομάδα 187 ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (23). Στην αναφερόμενη μελέτη οι συμμετέχοντες είχαν υψηλότερα επίπεδα HbA1c σε σύγκριση με τον πληθυσμό της μελέτης μας, ενώ περισσότεροι από τους μισούς συμμετέχοντες είχαν κλινική μακροαγγειακή νόσο. Επιπλέον, η νέα εμφάνιση ή εξέλιξη και των τριών μικροαγγειοπαθητικών επιπλοκών αξιολογήθηκαν σε συνδυασμό προκειμένου να αυξηθεί η ισχύς στη στατιστική ανάλυση. Η διαβητική νευροπάθεια, περιφερική και νευροπάθεια του αυτονόμου νευρικού συστήματος, δεν σχετίσθηκε με τους διάφορους φαινοτύπους CPCs/EPCs που μελετήθηκαν στα μοντέλα πολυπαραγοντικής ανάλυσης, ενώ η ισχυρότερη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των φαινοτύπων των CPCs και του ρυθμού απέκκρισης αλβουμίνης στα ούρα.

Η παθολογική νεοαγγειογένεση αποτελεί το κύριο χαρακτηριστικό της διαβητικής παραγωγικής αμφιβληστροειδοπάθειας (24). Σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 χωρίς μακροαγγειοπαθητικές επιπλοκές, τα EPCs έχουν βρεθεί μειωμένα σε αυτούς με μη παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια και αυξημένα σε αυτούς με παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια (25). Αυξημένοι αριθμοί CD34+/CD45- κυττάρων έχουν αναφερθεί σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη και παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια σε σύγκριση με υγιή άτομα, παρά την υψηλότερη συχνότητα μακροαγγειοπαθητικής νόσου τους ασθενείς με διαβήτη (24). Ωστόσο, in vitro μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύτταρα αυτά έχουν μικρότερη ικανότητα μετανάστευσης, ενσωμάτωσης και σχηματισμού αγγειακών δομών με ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς (24). Οι συγγραφείς της τελευταίας μελέτης θεωρούν ότι CD34+/CD45- κύτταρα από ασθενείς με παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια μπορούν απελευθερωθούν από το νωτιαίο μυελό στην κυκλοφορία, αλλά έχουν μειωμένη ικανότητα εγκατάστασης στο τραυματισμένο ενδοθήλιο και μειωμένη ικανότητα ενδοθηλιακής αποκατάστασης. Το ίδιο μπορεί να ισχύει και για τους ασθενείς της μελέτης μας με περιφερική νευροπάθεια που βρέθηκαν να έχουν αυξημένο αριθμό κυκλοφορούντων EPCs.

Καθόσον γνωρίζουμε,  προς το παρόν καμία μελέτη δεν έχει διερευνήσει αυτή καθαυτή τη συσχέτιση μεταξύ της περιφερικής νευροπάθειας και του αριθμού των CPCs/EPCs σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη. Οι Tecilazich et al εξέτασαν τις μεταβολές διαφόρων EPCs φαινοτύπων σε 4 ομάδες ατόμων: σε ασθενείς με διαβητικό έλκος, σε ασθενείς με κίνδυνο εμφάνισης διαβητικού έλκος, σε ασθενείς χωρίς κίνδυνο εμφάνισης διαβητικού έλκους και σε υγιείς μάρτυρες (14). Όπως και στην μελέτη μας, δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στους αριθμούς αρκετών EPCs φαινοτύπων (CD45dim/CD34+, CD45dim/CD34+/ KDR+, CD45dim/CD34+/CD133+, CD45dim/ΚDR+/CD133+ και CD45dim/CD34+/KDR+) μεταξύ των ασθενών με διαβήτη χωρίς κίνδυνο εμφάνισης διαβητικού έλκους και στους υγιείς μάρτυρες. Ωστόσο, οι ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια τέτοιου βαθμού ώστε να διατρέχουν κίνδυνο εμφάνισης διαβητικού έλκους είχαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό αρκετών EPCs φαινοτύπων (CD45dim/CD34+, CD45dim/CD34+/CD133+ και CD45dim/CD34+/KDR+/CD133+) σε σύγκριση με τα υγιή άτομα. Οι ασθενείς με  κίνδυνο εμφάνισης διαβητικού έλκους είχαν επίσης σημαντικά χαμηλότερους αριθμούς των φαινοτύπων CD45dim/CD34+, CD45dim/CD34+/CD133+, CD45dim/CD34+/CD133+, αλλά όχι των φαινοτύπων CD45dim/KDR+/CD133+ και CD45dim/CD34+/KDR+ σε σύγκριση με τους συμμετέχοντες χωρίς κίνδυνο εμφάνισης διαβητικού έλκους. Ωστόσο, οι συμμετέχοντες στην αναφερόμενη μελέτη είχαν σχετικά μεγαλύτερη διάρκεια διαβήτη και χειρότερο γλυκαιμικό έλεγχο σε σύγκριση με τους συμμετέχοντες της μελέτη μας. Η πιο σημαντική διαφορά όμως είναι ότι η μακροαγγειοπαθητική νόσος και η παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια, που μπορεί να σχετίζονται τόσο με μειωμένα όσο και με αυξημένα EPCs, δεν ήταν κριτήρια αποκλεισμού στη μελέτη από τους Tecilazich et al. Οι συγγραφείς ανέφεραν επίσης ότι τα επίπεδα των VEFG, SDF-1, VCAM και ICAM δεν διέφεραν μεταξύ των υγιών ατόμων, των ασθενών χωρίς κίνδυνο και των ασθενών με κίνδυνο εμφάνισης διαβητικού έλκους. Είναι ενδιαφέρον ότι το πειραματικό μέρος της μελέτης διαπίστωσε ότι ο αριθμός όλων των EPCs φαινοτύπων έτεινε να είναι υψηλότερος σε πειραματόζωα με σακχαρώδη διαβήτη σε σύγκριση με μη διαβητικά πειραματόζωα. Σύμφωνα με τους ερευνητές, δεδομένου ότι τα ζωικά μοντέλα στερούνται σοβαρών διαβητικών επιπλοκών, τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να υποδηλώνουν έλλειψη διαφορών στον αριθμό των EPCs μεταξύ υγιών ατόμων και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη χωρίς επιπλοκές.

Η σημασία των EPCs στην ομοιοστασία της μικροκυκλοφορίας των νεύρων ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι η μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων έχει εισαχθεί ως θεραπεία της περιφερικής νευροπάθειας τόσο σε πειραματικές όσο και σε κλινικές δοκιμές (26-29). Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η ηλεκτρική διέγερση των μυών στους μηρούς των ασθενών με επώδυνη περιφερική νευροπάθεια είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των επώδυνων συμπτωμάτων, πιθανώς λόγω  διαφοροποίησης των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων σε EPCs και αυξημένης εγκατάστασης των τελευταίων στο αγγειακό ενδοθήλιο (28). Άλλη μελέτη εξέτασε την επίδραση της απελευθέρωσης EPCs από το νωτιαίο μυελό και της κινητοποίησής τους στο σημείο της βλάβης με τη χορήγηση διεγερτικών παραγόντων σε πειραματόζωα με διαβήτη (29). Η συστηματική χορήγηση VEGF δεν αύξησε τα κυκλοφορούντα EPCs, αλλά η συστηματική χορήγηση του ανοσοδεγερτικού παράγοντα AMD3100, που έχει αναφερθεί ότι επάγει την κινητοποίηση των EPCs στην κυκλοφορία, μαζί με την τοπική χορήγηση SDF-1 είχε ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση των vasa nervosum του ισχιακού νεύρου και την βελτίωση της ταχύτητα αγωγής του τελευταίου. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα δυσλειτουργικά EPCs και τα μειωμένα επίπεδα του SDF-1 μπορεί να είναι ένας από τους παθογενετικούς μηχανισμούς που οδηγούν στη διαταραχή των vasa nervosum του ισχιακού νεύρου στην περιφερική νευροπάθεια. Στη μελέτη μας, οι ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια είχαν χαμηλότερα επίπεδα SDF-1 σε σύγκριση με τα υγιή άτομα και αυξημένο αριθμό EPCs στην κυκλοφορία, πιθανώς λόγω μειωμένης ενσωμάτωσης των τελευταίων στα αγγεία των νεύρων.

Τα EPCs βρίσκονται στις λεγόμενες “θέσεις” (niches) των βλαστικών κυττάρων στο μυελό των οστών και απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίματος από κυτταροκίνες, όπως ο VEGF ή ο SDF-1, που συντίθενται από τους ισχαιμικούς ιστούς (6, 17). Στη μελέτη μας, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα του VEFG μεταξύ των 3 ομάδων των συμμετεχόντων. Καθόσον γνωρίζουμε, τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τη συσχέτιση του VEGF με την περιφερική νευροπάθεια είναι περιορισμένα.

Μετά από διέγερση, τα EPCs μεταναστεύουν στις περιοχές του τραυματισμένου ενδοθηλίου όπου κυλούν και προσκολλώνται σε αυτό και προάγουν την ενδοθηλιακή αποκατάσταση. Ο SDF-1 θεωρείται ο ισχυρότερος χημειοτακτικός παράγοντας των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων.  Ο SDF-1 δεσμεύεται στον υποδοχέα του στην επιφάνεια των EPCs με αποτέλεσμα την προσκόλλησή των EPCs στο τραυματισμένο ενδοθήλιο (6, 20). Η ενσωμάτωση των EPCs στο αγγειακό ενδοθήλιο πιθανόν να προκαλείται μέσω ενεργοποίησης ιντεγκρινών που επάγονται από τον SDF-1 (30). Πειραματικές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση του SDF-1 ήταν μειωμένη σε τραύματα του δέρματος, ενώ η τοπική χορήγηση SDF-1 αύξησε την εγκατάσταση των EPCs στους τραυματισμένους ιστούς (31). Τα δεδομένα, ωστόσο, σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη είναι λιγοστά. Στη μελέτη μας, οι ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια είχαν χαμηλότερα επίπεδα SDF-1 στο πλάσμα σε σύγκριση με τους υγιείς συμμετέχοντες. Τα ευρήματά μας θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ότι περιφερική νευροπάθεια σχετίζεται με χαμηλές συγκεντρώσεις SDF-1, οι οποίες μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα μειωμένη εγκατάσταση των EPCs στο τραυματισμένο ενδοθήλιο και κατά συνέπεια αυξημένα επίπεδα των EPCs στην κυκλοφορία.

Τα VCAM-1 και ICAM-1 είναι κυτταρικά μόρια προσκόλλησης που εκφράζονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων και φαίνεται να προάγουν την προσκόλληση των αιμοποιητικών κυττάρων στα τραυματισμένα αγγεία (32). Στη μελέτη μας τα επίπεδα VCAM-1 και ICAM-1 στο πλάσμα δεν διέφεραν μεταξύ των 3 ομάδων των συμμετεχόντων.

O TNFa είναι μια φλεγμονώδης κυτταροκίνη που επίσης θεωρείται ότι εμπλέκεται στην κινητοποίηση και προσκόλληση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων στο τραυματισμένο ενδοθήλιο, παρότι δεν είναι σαφές προς το παρόν αν μια χρόνια φλεγμονώδης κατάσταση όπως ο σακχαρώδη διαβήτης ενισχύει ή παρεμποδίζει την κινητοποίηση των EPCs (6, 33, 34). Στη μελέτη μας δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα του TNFa στο πλάσμα μεταξύ των 3 ομάδων συμμετεχόντων.

Όσον αφορά άλλους παράγοντες που θα μπορούσαν να σχετίζονται με τον αριθμό των EPCs, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η θεραπεία με στατίνες, ορισμένα αντιδιαβητικά φάρμακα, όπως οι DPP4i, η μετφορμίνη και η πιογλιταζόνη, και κάποια αντιϋπερτασικά φάρμακα, όπως οι ACEi και οι ARBs, μπορεί να αυξήσει τον αριθμό των EPCs (6, 33). Στα διαβητικά άτομα της μελέτης μας με και χωρίς περιφερική νευροπάθεια δεν υπήρχαν διαφορές στον αριθμό των ατόμων που ελάμβαναν  αυτά τα φάρμακα, ενώ τα υγιή άτομα χρησιμοποιούσαν λιγότερο συχνά στατίνες και αντιϋπερτασικά φάρμακα. Έχει επίσης φανεί ότι ο αριθμός των EPCs σχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα με την ηλικία και τους καρδιαγγειακούς παράγοντες κινδύνου, όπως τα επίπεδα της LDL-χοληστερόλης (6, 33). Και πάλι, δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ ασθενών με και χωρίς περιφερική νευροπάθεια, ενώ οι υγιείς συμμετέχοντες είχαν υψηλότερες συγκεντρώσεις LDL-χοληστερόλης σε σύγκριση με τους ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια.

Η μελέτη μας έχει αρκετούς περιορισμούς. Πρώτον, πρόκειται για μια συγχρονική μελέτη που δεν μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για την αιτιολογική σχέση των συσχετίσεων που παρατηρήθηκαν ούτε να εξηγήσει τους υποκείμενους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς. Μηχανιστικά δεν γνωρίζουμε αν ο αυξημένος αριθμός των EPCs προκαλεί περιφερική νευροπάθεια ή αν ο αυξημένος αριθμός των EPCs αντιπροσωπεύει την αδυναμία αυτών των κυττάρων να εγκατασταθούν και να προσκολληθούν στο τραυματισμένο ενδοθήλιο η οποία με τη σειρά της επηρεάζει την νεοαγγειογένεση και την αποκατάσταση του περιφερικού νεύρου. Φαίνεται ελκυστικό να θεωρήσουμε ότι ο αυξημένος αριθμός των EPCs εμπλέκεται στην παθογένεια της νόσου τη στιγμή που μικροσκοπικά δεδομένα έχουν δείξει ότι ο αριθμός των αγγείων των νεύρων αυξάνει σαν απάντηση στην ισχαιμία των νευρικών ιστών στα πρώιμα στάδια του διαβήτη. Παρόλα αυτά, δεδομένων των κλινικών στοιχείων που έχουμε ως τώρα στη διάθεσή μας, φαίνεται πιθανότερο ότι ο αυξημένος αριθμός των EPCs σχετίζεται με την διαταραγμένη εγκατάστασή τους στο τραυματισμένο ενδοθήλιο.

Κατά δεύτερον, τα EPCs αποτελούνται από ετερογενείς πληθυσμούς κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις ωρίμανσης που εκφράζουν αρκετά αντιγόνα και επί του παρόντος δεν υπάρχει κοινή συναίνεση όσον αφορά την αναγνώρισής τους με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής. Για τον χαρακτηρισμό των EPCs έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετοί δείκτες επιφάνειας και διαφορετικά πρωτόκολλα αναγνώρισης, με αποτέλεσμα τα αντικρουόμενα ευρήματα διαφόρων μελετών να μπορεί να αποδοθούν, τουλάχιστον εν μέρει, στην έλλειψη ενός καλά καθορισμένου πληθυσμού EPCs. Ωστόσο, ένα από τα δυνατά σημεία της μελέτης μας είναι η συστηματική αξιολόγηση πολλών πιθανών φαινοτύπων EPCs προκειμένου να καταλήξουμε σε ένα σαφές πρότυπο αλλαγής (αύξησης ή μείωσης) των EPCs σε ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια.

Το πλεονέκτημα της μελέτης μας είναι η σχολαστική επιλογή των συμμετεχόντων μας. Οι ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 έχουν συνήθως πολλές συννοσηρότητες ή επιπλοκές που μπορούν να επηρεάσουν τον αριθμό των EPCs. Επιλέξαμε προσεκτικά συμμετέχοντες με καλό γλυκαιμικό έλεγχο και χωρίς κλινική μακροαγγειακή νόσο, παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια ή άλλες σοβαρές συννοσηρότητες, προκειμένου να αποκλείσουμε παράγοντες που θα μπορούσαν να σχετίζονται τόσο με μειωμένο όσο και με αυξημένο αριθμό EPCs.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τα κυκλοφορούντα EPCs είναι αυξημένα σε ασθενείς με περιφερική νευροπάθεια και καλό γλυκαιμικό έλεγχο χωρίς μακροαγγειοπαθητική νόσο σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς περιφερική νευροπάθεια και σε σύγκριση με υγιή άτομα. Παρόλο που η μελέτη μας δεν μπορεί αποδείξει τον υποκείμενο παθογενετικό μηχανισμό, μπορούμε να υποθέσουμε ότι τα EPCs αδυνατούν να εγκατασταθούν στο τραυματισμένο ενδοθήλιο λόγω έλλειψης αύξησης των μορίων που απαιτούνται για την προσκόλλησή τους, όπως ο SDF-1. Τα ευρήματά μας επισημαίνουν τη στενή αλληλεπίδραση μεταξύ των EPCs και της περιφερικής νευροπάθειας, αλλά ο ακριβής ρόλος αυτών των κυττάρων στην παθογένεια της περιφερικής νευροπάθειας παραμένει να καθοριστεί σε περαιτέρω μελέτες. Επιπλέον, η περιφερική νευροπάθεια είναι μία προοδευτική επιπλοκή του διαβήτη και οι εκδηλώσεις της μπορεί να εξελιχθούν και να διαφοροποιηθούν μέσα στην πάροδο των ετών. Επομένως, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι ο αριθμός των EPCs μπορεί επίσης να μεταβάλλεται στα διάφορα στάδια της περιφερικής νευροπάθειας, καθώς αυτά χαρακτηρίζονται από διαφορετικές δομικές και λειτουργικές διαταραχές των vasa nervosum. Συνολικά, τα EPCs συμμετέχουν και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην περιφερική νευροπάθεια. Ωστόσο, το ζήτημα της σημασίας και της θεραπευτικής τους χρήσης παραμένει ανοιχτό. Κλινικές προοπτικές μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό συμμετεχόντων και με την εφαρμογή αντικειμενικών μεθόδων για τον ποσοτικό προσδιορισμό των EPCs χρειάζονται για να επιβεβαιωθεί η σημασία των EPCs στην παθογένεια και τη θεραπεία της περιφερικής νευροπάθειας.

Ευχαριστίες

Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε από την Ελλάδα και την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού, Εκπαίδευση και Διά Βίου Μάθηση», στο πλαίσιο της Πράξης «Ενίσχυση Μεταδιδακτόρων ερευνητών/ερευνητριών» (MIS-5001552), που υλοποιεί το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ).

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Boulton AJ, Malik RA, Arezzo JC, Sosenko JM. Diabetic somatic neuropathies. Diabetes care 2004; 27: 1458-1486.
2. Callaghan BC, Cheng HT, Stables CL, et al. Diabetic neuropathy: clinical manifestations and current treatments. The Lancet Neurology 2012; 11: 521-534.
3. Boulton AJ, Vinik AI, Arezzo JC, et al. Diabetic neuropathies: a statement by the American Diabetes Association. Diabetes care 2005; 28: 956-962.
4. Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes 2005; 54: 1615-1625.
5. Menegazzo L, Albiero M, Avogaro A, Fadini GP. Endothelial progenitor cells in diabetes mellitus. BioFactors 2012; 38: 194-202.
6. Kang H, Ma X, Liu J, et al. High glucose-induced endothelial progenitor cell dysfunction. Diabetes & vascular disease research 2017; 14: 381-394.
7. Fadini GP. A reappraisal of the role of circulating (progenitor) cells in the pathobiology of diabetic complications. Diabetologia 2014; 57: 4-15.
8. Fadini GP, Sartore S, Agostini C, Avogaro A. Significance of endothelial progenitor cells in subjects with diabetes. Diabetes care 2007; 30: 1305-1313.
9. American Diabetes A. 10. Cardiovascular Disease and Risk Management: Standards of Medical Care in Diabetes-2019. Diabetes care 2019; 42: S103-S123.
10. American Diabetes A. Peripheral arterial disease in people with diabetes. Diabetes care 2003; 26: 3333-3341.
11. Fong DS, Aiello L, Gardner TW, et al. Diabetic retinopathy. Diabetes care 2003; 26 Suppl 1: S99-S102.
12. Tuttle KR, Bakris GL, Bilous RW, et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference. Diabetes care 2014; 37: 2864-2883.
13. Young MJ, Boulton AJ, MacLeod AF, et al. A multicentre study of the prevalence of diabetic peripheral neuropathy in the United Kingdom hospital clinic population. Diabetologia 1993; 36: 150-154.
14. Tecilazich F, Dinh T, Pradhan-Nabzdyk L, et al. Role of endothelial progenitor cells and inflammatory cytokines in healing of diabetic foot ulcers. PloS one 2013; 8: e83314
15. Bonhof GJ, Herder C, Strom A, et al. Emerging Biomarkers, Tools, and Treatments for Diabetic Polyneuropathy. Endocrine reviews 2019; 40: 153-192.
16. Yagihashi S. Pathology and pathogenetic mechanisms of diabetic neuropathy. Diabetes/metabolism reviews 1995; 11: 193-225.
17. Han JW, Sin MY, Yoon YS. Cell therapy for diabetic neuropathy using adult stem or progenitor cells. Diabetes & metabolism journal 2013; 37: 91-105.
18. Kim H, Kim JJ, Yoon YS. Emerging therapy for diabetic neuropathy: cell therapy targeting vessels and nerves. Endocrine, metabolic & immune disorders drug targets 2012; 12: 168-178.
19. Mizukami H, Yagihashi S. Exploring a new therapy for diabetic polyneuropathy – the application of stem cell transplantation. Frontiers in endocrinology 2014; 5: 45.
20. Yiu KH, Tse HF. Specific role of impaired glucose metabolism and diabetes mellitus in endothelial progenitor cell characteristics and function. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2014; 34: 1136-1143.
21. Caballero S, Sengupta N, Afzal A, et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes 2007; 56: 960-967.
22. Fadini GP, Rigato M, Cappellari R, et al. Long-term Prediction of Cardiovascular Outcomes by Circulating CD34+ and CD34+CD133+ Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes. Diabetes care 2017; 40: 125-131.
23. Rigato M, Bittante C, Albiero M, et al. Circulating Progenitor Cell Count Predicts Microvascular Outcomes in Type 2 Diabetic Patients. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 2015; 100: 2666-2672.
24. Tan K, Lessieur E, Cutler A, et al. Impaired function of circulating CD34(+) CD45(-) cells in patients with proliferative diabetic retinopathy. Experimental eye research 2010; 91: 229-237.
25. Brunner S, Hoellerl F, Schmid-Kubista KE, et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Investigative ophthalmology & visual science 2011; 52: 4655-4662.
26. Naruse K, Hamada Y, Nakashima E, et al. Therapeutic neovascularization using cord blood-derived endothelial progenitor cells for diabetic neuropathy. Diabetes 2005; 54: 1823-1828.
27. Jeong JO, Kim MO, Kim H, et al. Dual angiogenic and neurotrophic effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells on diabetic neuropathy. Circulation 2009; 119: 699-708.
28. Hidmark A, Spanidis I, Fleming TH, et al. Electrical Muscle Stimulation Induces an Increase of VEGFR2 on Circulating Hematopoietic Stem Cells in Patients With Diabetes. Clinical therapeutics 2017; 39: 1132-1144. e1132
29. Kim BJ, Lee JK, Schuchman EH, et al. Synergistic vasculogenic effects of AMD3100 and stromal-cell-derived factor-1alpha in vasa nervorum of the sciatic nerve of mice with diabetic peripheral neuropathy. Cell and tissue research 2013; 354: 395-407.
30. Petit I, Jin D, Rafii S. The SDF-1-CXCR4 signaling pathway: a molecular hub modulating neo-angiogenesis. Trends in immunology 2007; 28: 299-307.
31. Gallagher KA, Liu ZJ, Xiao M, et al. Diabetic impairments in NO-mediated endothelial progenitor cell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF-1 alpha. The Journal of clinical investigation 2007; 117: 1249-1259.
32. Perlin JR, Sporrij A, Zon LI. Blood on the tracks: hematopoietic stem cell-endothelial cell interactions in homing and engraftment. Journal of molecular medicine 2017; 95: 809-819.
33. Yu CG, Zhang N, Yuan SS, et al. Endothelial Progenitor Cells in Diabetic Microvascular Complications: Friends or Foes? Stem cells international 2016; 2016: 1803989
34. Prisco AR, Prisco MR, Carlson BE, Greene AS. TNF-alpha increases endothelial progenitor cell adhesion to the endothelium by increasing bond expression and affinity. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2015; 308: H1368-1381.